| kirjeldus: |
Projekti eesmärgiks on luua uus meetod valkude interaktsiooni uurimiseks: bakteriaalne kaksikhübriidne süsteem, mis põhineks sigma54-sõltuva promootori aktivatsioonil. See uudne süsteem oleks lihtsam, kiirem ja mugavam kui traditsiooniline pärmi kaksikhübriidne meetod. Bakteri sigma54-sõltuv promootor sarnaneb organisatsioonilt ja regulatsioonilt eukarüoodi promootoritele, mida kasutatakse pärmi kaksikhübriidses süsteemis. Transkripsiooni aktiveerivad modulaarse ehitusega aktivaatorvalgud, mille koosseisu kuuluvad DNA-d siduv ja transkripsiooni aktiveeriv domeen. Interaktsiooni testimiseks konstrueeritakse hübriidsete valkude paar, milles uuritava valguga X on liidetud DNA-d siduv domeen ja valguga Y transkriptsiooni aktiveeriv domeen. Reportergeeni transkriptsioon sigma54-sõltuvalt promootorilt aktiveeritakse ainult juhul kui X ja Y omavahel interakteeruvad. Süsteem konstrueeritakse töötamiseks Escherichia coli rakkudes, selles kasutatakse Pseudomonas putida TOL plasmiidi XylR aktivaatorist pärit valgudomeene ja XylR-i poolt reguleeritavat Pu promootorit. Meetodi testimiseks ja "häälestamiseks" kasutatkse XY valke, mille omavaheline interaktsioon on varem iseloomustatud. Testitakse ka süsteemi sobivust X valgu interaktsioonipartnerite leidmiseks cDNA raamatukogu selektsioonil. |